|
Szczegóły Produktu:
|
| nazwy produktów: | qPCR | Temperatura przechowywania: | –20°C |
|---|---|---|---|
| Solidny i aktywny w syntezie cDNA: | do 55°C. | Aplikacja: | PCR |
| Tom: | 1ml | Transkrypcja odwrotna: | zakres temperatur (42-60°C) |
| High Light: | Uniwersalny TaqMan Multiplex QPCR,TaqMan Multiplex QPCR Biochemiczny Odczynnik,1 ml TaqMan Multiplex QPCR |
||
Uniwersalny miks qPCR multipleksowy TaqMan
Zasady projektowania podkładów:
1. Zaleca się, aby długość produktu amplifikacji wynosiła 80-300 pz;
2. Długość podkładu: 18-25 pz;
3. Zawartość zasady G+C w podkładach powinna wynosić 40%-60%;
4. Różnica wartości Tm między starterami przednimi i starterami wstecznymi jest mniejsza niż 2℃, a wartość Tm między 58-62℃ jest najlepsza;
5. Losowość rozkładu baz;
6. Lepiej by startery nie zawierały sekwencji samouzupełniających się, w przeciwnym razie utworzą drugorzędną strukturę spinki do włosów;
7. Pomiędzy dwoma starterami nie powinno być więcej niż 4 komplementarne lub homologiczne zasady, w przeciwnym razie powstanie dimer startera, zwłaszcza komplementarne nakładanie się na końcu 3';
8. Sugeruje się, że zasada na końcu 3' startera to G lub C;
9. W wynikach porównawczych NCBI nie znaleziono innych niespecyficznych produktów.
Wprowadzenie uniwersalnego miksu qPCR multipleksu Universal TaqMan:
Produkt ten jest 2x roztworem premiksu do qPCR przy użyciu chimerycznej metody fluorescencji GSK Green I.Główny składnik, Taq DNA Polymerase, jest aktywowaną termicznie polimerazą DNA blokowaną metodą przeciwciał, która może skutecznie hamować nieswoistą amplifikację w warunkach niskiej temperatury.Tymczasem, w połączeniu z buforem reakcyjnym zoptymalizowanym pod kątem qPCR, Taq DNA Polymerase jest bardzo odpowiednia do reakcji qPCR o wysokiej specyficzności i czułości.Dobrą krzywą wzorcową można uzyskać w szerokim obszarze ilościowym, co jest dokładne, powtarzalne i niezawodne w ilościowej analizie genów docelowych.Jednocześnie produkt ten zawiera specjalny pasywny barwnik referencyjny ROX, który jest odpowiedni do stosowania we wszystkich aparatach qPCR i nie ma potrzeby dostosowywania stężenia ROX w różnych aparatach.Do premiksu dodawany jest niebieski barwnik, który daje efekt znacznika dodawania próbek, a jednocześnie dostarczany jest żółty rozcieńczalnik matrycowy.Gdy matryca jest rozcieńczana żółtym rozcieńczalnikiem matrycowym i dodawana do niebieskiej przedmieszki reakcyjnej, kolor zmienia się z niebieskiego na zielony, co może odgrywać rolę znacznika w przygotowaniu procesu układu reakcyjnego i zapobiegać wyciekowi lub niewłaściwemu dodaniu.Widma barwników niebieskiego i żółtego nie nakładają się na barwniki qPCR i nie wpływają na wyniki reakcji.
Protokół testu / Procedury dotycząceUniwersalny miks qPCR multipleksowy TaqMan:
1. (Opcjonalnie) rozcieńczenie szablonu:
Ten zestaw zawiera 40-krotnie ŻÓŁTY bufor rozcieńczania szablonu, 40-krotnie rozcieńczony żółty roztwór szablonu, którego można użyć do dokładnego określenia, czy szablon został dodany do płynu reakcyjnego qPCR poprzez zmianę koloru płynu.Biorąc jako przykład układ reakcyjny 20ul qPCR, zgodnie z ilością szablonu rozcieńczenia dodaną do 20ul roztworu reakcyjnego qPCR, odpowiednią metodę rozcieńczenia oryginalnego szablonu można odnieść do poniższej tabeli (przyjmując oryginalną matrycę rozcieńczoną do 100ul jako przykład ):
| Dodaj rozcieńczony szablon do 20ul roztworu reakcyjnego qPCR(ul) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Dodaj 40x ŻÓŁTY bufor do rozcieńczania szablonów do systemu rozcieńczania szablonów 100ul(ul) | 50 | 25 | 16,7 | 12,5 | 10 | 8.4 | 7,2 | 6,3 |
| Dodaj 100ul Template Dilution System do podstawowego szablonu (ul) | x | x | x | x | x | x | x | x |
| objętość dodawania Nuclease - Free Water(ul) | 50-x | 75-x | 83,3-x | 87,5-x | 90-x | 91,6-x | 92,8-x | 93,7-x |
Przykład:
2ul rozcieńczonego szablonu należy dodać do 20ul układu reakcyjnego qPCR.
Biorąc jako przykład system 100ul Template Dilution, gdy oryginalna objętość szablonu wynosi 20ul, dodaje się 25ul 40x Yellow Template Dilution Buffer, a następnie dodaje się wodę bez nukleazy 55ul do całkowitej objętości 100ul.
40x ŻÓŁTY BUFOR ROZCIEŃCZANIA SZABLONU jest teraz 10x.Dodaj 2 ul rozcieńczonego szablonu do 20 ul buforu rozcieńczania do rozcieńczania, a końcowy bufor do rozcieńczania 40 x ŻÓŁTY do rozcieńczania szablonów ma 1x.Podsumowując, Yellow Template Dilution Buffer powinien wynosić 1x w końcowym systemie qPCR.
Informacje o produkcie Universal TaqMan multiplex qPCR master mix:
| Nazwa produktu | Identyfikacja produktu | Model |
| Uniwersalny miks qPCR multipleksowy TaqMan | GS-MBP0044-01 | 1ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 ml | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 ml |
Warunki przechowywania i obsługi z uniwersalnym master mixem TaqMan multiplex qPCR:
Transport worków na mokry lód;Przechowywany w temperaturze -20℃, ważny przez 12 miesięcy.
Notatka:Jeśli szablon nie musi być rozcieńczany lub jeśli nie jest używany rozcieńczalnik szablonu G3362-2, można zignorować ten krok.
2.Procedura reakcji PCR (może być dostosowana do instrumentów):
a: Jeśli specyficzność amplifikacji wymaga poprawy, można zastosować procedurę dwuetapową lub temperaturę przyłączania;Aby poprawić wydajność amplifikacji, można zastosować procedurę trzystopniową lub czas przedłużenia.
Notatka:
1. Podczas pracy należy nosić rękawiczki jednorazowe, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą.
2. Produkty odwrotnej transkrypcji mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze -20 ℃.Jeśli potrzebne jest długoterminowe przechowywanie, zaleca się przechowywanie ich w temperaturze -80 ℃ po zapakowaniu, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania-rozmrażania.
3. Jeśli matryca jest pochodzenia eukariotycznego, zaleca się wybranie startera Oligo (dT)18 i sparowanie go z ogonem 3' Poly A eukariotycznego mRNA, aby uzyskać najwyższą wydajność pełnej długości cDNA.
4. Do odwrotnej transkrypcji prokariotycznego RNA należy użyć Random Hexamer Primer lub Gene Specific Primer.
5. Random Hexamer Primer ma szerokie zastosowanie i jest odpowiedni dla matryc mRNA, rRNA, tRNA, small RNA i lncRNA.
6. Jeśli po odwrotnej transkrypcji następuje test qPCR, Oligo (dT)18 Primer i Random Hexamer Primer można zmieszać, aby wydajność syntezy cDNA była taka sama we wszystkich regionach mRNA, co pomaga poprawić autentyczność i powtarzalność wyników ilościowych.
7. Jeśli kolejne startery qPCR są zaprojektowane w poprzek eksonów, etap usuwania genomu można pominąć.
Typowe problemy i rozwiązania:
| Opis problemu | Możliwe przyczyny | Rozwiązania |
| Pod koniec reakcji nie pojawiła się krzywa amplifikacji lub wartość CT pojawiła się zbyt późno | Stężenie matrycy jest zbyt niskie | Powtórz doświadczenie, aby zmniejszyć wielokrotność rozcieńczeń matrycy i zacznij od najwyższego stężenia, gdy stężenie próbki jest nieznane |
| Degradacja szablonu | Szablon został przygotowany ponownie i eksperyment powtórzono | |
| W systemie są inhibitory PCR | Zasadniczo matryca jest przenoszona, współczynnik rozcieńczenia matrycy jest zwiększany lub matryca o wysokiej czystości jest ponownie przygotowywana i powtarzana | |
| Startery mogą ulec degradacji | Startery, które nie były używane przez długi czas, należy najpierw przetestować pod kątem integralności za pomocą elektroforezy PAGE, aby wykluczyć możliwość degradacji | |
| Niska wydajność wzmocnienia | zwiększ stężenie startera, wypróbuj trzyetapową procedurę amplifikacji lub przeprojektuj starter | |
| Produkt wzmacniający jest za długi | Długość produktu amplifikacji kontrolowano w zakresie 80-300 pz | |
| Pusta kontrolka pokazuje sygnał | Zanieczyszczenie układu reakcyjnego | Po pierwsze, należy wymienić ślepą wodę kontrolną.Jeśli ta sama sytuacja nadal występuje, startery, aspiratory i probówki do PCR należy wymienić lub rozpocząć nową mieszankę Master Mix.System reakcyjny jest przygotowany w super czystym stole, aby zmniejszyć zanieczyszczenie aerozolem |
| Pojawia się nieswoista amplifikacja, taka jak dimery starterów |
Ogólnie rzecz biorąc, normalne jest, że produkty amplifikacji pojawiają się w ślepej próbie po 35 cyklach, co należy analizować za pomocą krzywej topnienia. Przeprojektuj starter, dostosuj stężenie startera lub zoptymalizuj procedurę reakcji PCR |
|
| Krzywa topnienia ma wiele pików | Projekt podkładu jest słaby | Nowy podkład został przeprojektowany zgodnie z zasadami projektowania podkładów |
| Stężenie primera jest zbyt wysokie | Odpowiednio zmniejsz stężenie podkładu | |
| W matrycy cDNA występuje zanieczyszczenie genomowe | Wyekstrahowany roztwór RNA jest trawiony przy użyciu enzymów DNA, takich jak DSDNaza, w celu usunięcia zanieczyszczeń genomowych lub zaprojektowania starterów transintronowych | |
| Słaba odtwarzalność eksperymentów | Błąd dodawania próbki jest duży |
Zastosowanie dokładnej pipety, z wysokiej jakości głowicą ssącą dokładną pipetę; Szablon o wysokim rozcieńczeniu, dodając szablon o dużej objętości w celu zmniejszenia błędu próbkowania; Zwiększono objętość reakcji qPCR |
| Stężenie matrycy jest zbyt niskie | Powtórz eksperyment, aby skrócić czasy rozcieńczania szablonu | |
| Odchylenie temperatury w różnych miejscach przyrządu qPCR | Regularnie kalibruj przyrząd qPCR | |
| Krzywa wzmocnienia nie jest gładka | Sygnał fluorescencyjny jest zbyt słaby, wytworzony po korekcji systemu |
Upewnij się, że barwniki wstępnie zmieszane w Master Mix nie uległy degradacji; Wymień sygnał fluorescencyjny, aby zebrać lepsze materiały eksploatacyjne do qPCR |
| Krzywa amplifikacji załamuje się lub ześlizguje | Stężenie matrycy było wyższe, a wyjściowa wartość punktu końcowego była wyższa niż wartość CT | Wyjściowy punkt końcowy (wartość Ct -3) został zmniejszony, a dane ponownie przeanalizowano |
| Krzywe amplifikacji poszczególnych Wells nagle gwałtownie spadły | W rurce reakcyjnej są bąbelki |
Upewnij się, że MIX jest całkowicie rozpuszczony i nie wiruje i nie oscyluje równomiernie; Po dodaniu próbki pęcherzyki usuwa się przez odwirowanie z lekką gumką. Czas wstępnej denaturacji przedłużono do 10 min w celu usunięcia pęcherzyków |
Jeśli potrzebujesz więcej informacji na temat uniwersalnego miksu qPCR multipleksu Universal TaqMan, daj nam znać online, dziękuję .
Osoba kontaktowa: Ms Kris
Tel: +8613049739311
